克唑替尼和依维莫司协同抑制间变性大细胞淋巴瘤的增殖

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所属分类:依维莫司

间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)是一种罕见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤,其中超过 50% 的病例具有异常的核磷蛋白(NPM)-间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合蛋白。雷帕霉素 (mTOR) 抑制剂依维莫司和 ALK 抑制剂克唑替尼的机制靶点均在 ALK 阳性癌细胞系中显示出有希望的抗癌活性。然而,它们的综合作用尚未得到研究。

克唑替尼和依维莫司协同抑制间变性大细胞淋巴瘤的增殖

我们评估了依维莫司和/或克唑替尼在 ALK 阳性 ALCL 细胞系 Karpas 299 和 SU-DHL-1 以及肺腺癌细胞系 NCI-H2228 中的抗增殖作用。

克唑替尼和依维莫司协同抑制间变性大细胞淋巴瘤的增殖

结果

克唑替尼和依维莫司协同抑制间变性大细胞淋巴瘤的增殖

我们发现,依维莫司和克唑替尼在 Karpas 299 和 SU-DHL-1 细胞中均以剂量依赖性方法有效抑制细胞生长。这些药剂的组合协同抑制了两种细胞系的增殖。克唑替尼下调依维莫司诱导的异常 AKT 和 ERK 磷酸化。与单独使用依维莫司或克唑替尼相比,在 ALK 阳性 ALCL 细胞中,联合医治还显着延长了 G0/G1 细胞周期停滞、DNA 损伤和细胞凋亡。在 Karpas 299 异种移植模型中,联合医治比单一治疗方法发挥更强的抗癌作用,而体重没有显着变化。依维莫司和克唑替尼的协同作用也在 ALK 阳性肺腺癌细胞系 NCI-H2228 中重现。

结论

克唑替尼联合依维莫司协同抑制ALK阳性ALCL细胞增殖。我们的研究结果表明,这种新的组合值得在 ALK 阳性 ALCL 患病者中进行进一步的临床开发。

在这项研究中,依维莫司、mTOR 抑制剂和 ALK 抑制剂克唑替尼的组合在 ALK 阳性临床前模型中显示出协同抗癌活性。我们显示依维莫司延长了 ALK 阳性 ALCL 细胞中的 AKT 和 ERK 磷酸化。克唑替尼联合依维莫司通过消除依维莫司诱导的异常 AKT 和 ERK 磷酸化表现出协同细胞毒性。此外,这种联合医治显着延长了 G0/G1 细胞周期停滞、DNA 损伤和细胞凋亡。此外,这种抗增殖活性能够转化为 ALCL体内异种移植模型。

mTOR 讯号通路在许多人类恶性肿瘤中经常失调,包括 ALCL ;因此,预计抑制 mTOR 将是医治多种恶性肿瘤的有希望的策略。目前,有几种 mTOR 抑制剂正在临床开发中作为抗肿瘤治疗方法。然而,以前的报告表明,使用rapalogs抑制 mTORC1 会通过几种不同的机制导致 AKT 和 ERK的上调。mTORC1 的主要底物之一 p70S6K 通过反馈机制调节通路,其中 PI3K 被 IRS1 下调抑制。因此,使用下调 p70S6K 的 rapalogs 抑制 mTORC1 会导致 PI3K 激活。p70S6K 还通过 Rictor 在 Thr1135 处的磷酸化抑制 mTORC2 。因此,rapalogs 对 p70S6K 的下调允许 mTORC2 活性,从而导致 Ser473 上的 AKT 磷酸化。此外,mTOR 抑制延长了血小板衍生生长因子受体的表达,导致 Ser473 上的 AKT 磷酸化进一步延长。ERK 激活也由 mTORC1 通过恶性肿瘤患病者的 p70S6K-IRS-Ras 通路抑制以及体外实验和前列腺癌的临床前模型触发。在我们的研究中,克唑替尼减弱了依维莫司引发的 AKT 和 ERK 激活。

在 ALK 阳性 ALCL 细胞中,异常的NPM-ALK融合基因激活 Ras/ERK、STATs 和 PI3K/AKT 讯号通路。克唑替尼在体外和体内都能有效抑制 ALK、AKT、ERK、PLC-γ 和 STAT3 的磷酸化。先前的一份报告显示,两名 ALK 阳性 ALCL 患病者在克唑替尼医治后能够实现快速完全缓解,即使他们之前在 CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松)化学疗法后重复发。克唑替尼单药医治重复发或难治性 ALK 阳性 NHL 患病者的另一项临床研究报告总缓解率为 91%(11 人中有 10 人),2 年总生存几率和无进展生存几率区别为 72.7% 和 63.7%。然而,尽管接受了克唑替尼医治,仍有相当一部分患病者最终出现重复发或进展,这可能是由于医治时间段对克唑替尼产生了获得性耐受药物。在之前的 ALK 阳性 ALCL 的临床前克唑替尼研究中,Christensen 等人证明克唑替尼在下调磷酸化 AKT(mTOR 的主要上游分子)方面无效,即使在完全抑制磷酸化 ALK 的剂量下也是如此。贝瑞等人证明,虽然克唑替尼消除了 ALK 磷酸化,但它对ALKF1174L/MYCN神经母细胞瘤模型中的 AKT、S6K 和 4EBP1 磷酸化影响不大,由此得出结论,对克唑替尼的耐受药物性可能与包括 mTOR 在内的关键讯号通路的不完全抑制有关。因此,我们假设克唑替尼可能更有效地用作与其他化学疗法药品联合医治的一部分,而不是单一治疗方法。

至于作用机制,克唑替尼与 ALK 酶的 ATP 结合位点结合,随后阻止自身磷酸化。根据我们的蛋白质印迹结果,Megiorni 等人证明克唑替尼医治可抑制横纹肌肉瘤细胞中 ALK、AKT 和 ERK 的磷酸化。然而,与克唑替尼医治相关的这些分子的总蛋白表达水平没有变化。至于依维莫司,它通过结合亲免素 FK 结合蛋白 12 发挥作用,从而抑制 mTOR 的激活。与我们的实验数据一致,Xu 等人证明依维莫司医治弥漫性大 B 细胞淋巴瘤细胞系显着减少 AKT (Thr308)、mTOR (Ser2448)、p70S6K 和 4E-BP-1 (Thr37/46) 的磷酸化,而总蛋白表达水平没有相应变化这些分子中。这些数据表明,两种靶向药物物都不是在转录水平上起作用。因此,这两种靶向药物物通过减少靶分子的磷酸化对讯号通路发挥抑制作用。

我们的研究结果表明,一方面,这种新型组合的协同抗增殖作用表明,抑制 ALK 能够通过抑制下游 PI3K/AKT 和 Ras/ERK 讯号通路来帮助克服 ALK 阳性 ALCL 细胞中的依维莫司耐受药物性。此外,加入克唑替尼后,依维莫司对 mTORC1 和 p70S6K 下调的作用得到加强。另一方面,克唑替尼对 mTOR 磷酸化的影响较小,尤其是对 AKT 下游靶点 Ser2448 的影响。克唑替尼的这种局限性能够通过添加依维莫司来克服。在我们测试的三种 ALK 阳性细胞系中,添加到克唑替尼中的依维莫司进一步均匀地减少了 mTOR 磷酸化。最近,克唑替尼和另一种 mTOR 抑制剂 temsirolimus 之间的协同作用,Redaelli 等人报道了在 ALK 阳性 ALCL 细胞系中。在他们的研究中,联合医治在体外和体内均抑制肿瘤生长,以及 G0/G1 期的明显细胞周期阻滞,这与我们的研究一致。此外,我们的研究强调了 ALK 和 mTOR 抑制剂的协同抗癌作用是通过有效抑制 mTOR 讯号的上游和下游而增强的细胞凋亡介导的具体机制。这些结果表明,联合医治能够克服抗 ALK 或抗 mTOR 单一治疗方法的局限性。然而,依维莫司或克唑替尼对 4E-BP1 磷酸化的影响在所测试的细胞系中并不一致。先前的一项研究表明,雷帕霉素能够在 6 小时内诱导 4E-BP1 磷酸化,尽管在 3 小时内进行了初始抑制。克唑替尼还能够在 ALK 阳性肺癌细胞中诱导 4E-BP1 磷酸化,尽管确切的机制仍然未知。克唑替尼和依维莫司的组合没有改变 Karpas 299 细胞中的 4E-BP1 磷酸化,而它显着减少了 SU-DHL-1 和 NCI-H2228 细胞中的 4E-BP1 磷酸化。在先前使用肺癌细胞进行的研究中,雷帕霉素诱导的 4E-BP1 磷酸化可被 BKM120(一种 PI3K 抑制剂)或 BEZ235(一种 PI3K/mTOR 双激酶抑制剂)消除。因此,假设 PI3K 抑制可能适用于克服克唑替尼和依维莫司联合医治的局限性。

在体外和体内实验中,克唑替尼和依维莫司的组合协同抑制了 ALK 阳性 ALCL 细胞的增殖。克唑替尼抑制依维莫司诱导的异常 AKT 和 ERK 磷酸化,并且比依维莫司单药医治更有效地抑制 mTOR 的活性,导致 G0/G1 细胞周期停滞、DNA 损伤和细胞凋亡延长。因此,在 ALK 阳性 ALCL 中需要使用克唑替尼和依维莫司联合进行进一步的临床实验。我们建议这种新的组合可用于改善 ALK 阳性 ALCL 患病者的医治结果。

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